Mecanismos de Detección
Pseudomonas aeruginosa
Luego de realizar un antibiograma un resultado de imipenem de 6 mm es predictor de cepas carbapenemasas tipo KPC o una metalo Beta Lactamasa y para confirmar la presencia de estas enzimas se realizan pruebas fenotípicas de detección, ya que la resistencia a carbapenémicos puede ser debida a otros mecanismos no enzimáticos como impermeabilidad, el cual afecta principalmente a imipenem.
Detección de carbapenemasas
Para poder confirmar la presencia de estas enzimas se deben realizar diversos test fenotípicos tales como el test de carba NP y Blue Carpa.
Carba NP
Método colorimétrico que utiliza como indicador de pH rojo fenol, gracias al cual cuando se produce la hidrólisis del imipenem por presencia de la carbapenemasa, vira el indicador de rojo a amarillo
PROCEDIMIENTO
Para cada aislamiento a testear, se debe emulsionar una asada (1µL) de la cepa en estudio incubada toda la noche en placa de agar sangre en los tubos rotulados como "a" y" b". Cabe destacar que no se debe usar un cultivo bacteriano de placas selectivas o que contengan otros tipos de antibióticos.
- Agitar cada tubo por 5 segundo.
- Agregar 100 µL de Solución A al tubo "a".
- Agregar 100 µL de Solución B al tubo "b".
- Agitar ambos tubos incubar a 35°C ± 2 °C hasta por 2 horas.
RESULTADOS
Aislamientos que demuestren resultados positivos antes de 2 horas pueden ser informados como productores de carbapenemasas.
Blue Carba
Este es una modificación del test Carba NP en donde se ocupa azul de bromotimol como indicador de pH el cual ante la presencia de hidrolisis del imipenem vira de azul a amarillo.
PROCEDIMIENTO
Por cada cepa a ensayar se utilizan 2 pocillos de una policubeta de 96 pocillos o dos tubos eppendorf.
- Agregar 100µL de solución A (pocillo/tubo control) o 100µL de solución A + 3 mg/mL (pocillo/tubo reacción).
- A cada pocillo agregar una ansa de 5µL completa con colonias crecidas en placas de MH, TSA, BHI, CLDE, placa colorimétrica, Agar Sangre o ChromKPC y resuspenderla para luego tapar.
- Incubar 35 - 37°C por un máximo de 2 horas en agitación.
RESULTADOS
Viraje de azul a amarillo resultado positivo, cepa productora de carbapenemasa.
Sin viraje de color, resultado negativo, no se detecta carbapenemasa.
Bacilos Gram negativo no fermentadores (general)
Detección de AmpC
Cabe destacar que no existen métodos fenotípicos estandarizados según la CLSI, sin embargo se han empleado diversos procedimientos con elevado sensibilidad y especificidad.
Métodos de aproximación de discos
Este método es aplicable a AmpC inducibles, se basa en realizar un antibiograma convencional para luego colocar un disco de cefoxitina a una distancia de 27 mm centro-centro de un disco de cefamandol, ceftazidima, ceftriaxona o cefotaxima (antimicrobiano sustrato).
Otras combinaciones de inductor sustratos ocupadas:
- Cefoxitina - Piperaciclina
- Imipenem - Ceftazidima
- Imipenem - Piperaciclina/tazobactam
- Imipenem - cefoxitina
RESULTADOS
En los microorganismos productores de estas enzimas se observa un halo de inhibición truncado del antimicrobiano sustrato.
Ante estas pruebas positivas se debe alertar al clínico la presencia de una betalactamasa inducible porque puede ocasionar un fracaso en el tratamiento.
Detección con inhibidores específicos
Se ocupa para para muestras de cepas derreprimidas, hiperproductoras o con betalactamasas AmpC plasmídicas constitutivas, en las que el método de aproximación de discos no tiene utilidad.
TIPOS
Cloxacilina
- Consiste en inocular la cepa en estudio en placas con agar Mueller-Hinton según métodos convencionales, para luego colocar un disco de cloxacilina (500µg) y a ambos lados, discos de ceftazidima (30µg) y cefotaxima (30µg) a una distancia de 25mm centro-centro.
- Un aumento del halo de inhibición de las cefalosporinas adyacente a la cloxacilina, se interpreta como prueba positiva para la producción de AmpC
Aztreonam y ácido fenil borónico (inhibidor competitivo reversible)
- Se debe realizan un antibiograma convencional con discos de cefotetán (30µg) solos y suplementados con 20µl de una solución de AFB (400µg).
- Un aumento del halo de inhibición de las cefalosporinas adyacente a la cloxacilina, se interpreta como prueba positiva para la producción de AmpC .
Detección de coexistencia de BLEE y AmpC
Es una técnica en la que se ocupa acido fenil brónico (AFB), cabe destacar que la CLSI indica que se debe incluir acido clavulánico, dado que las AmpC resisten la inhibición por el clavulanato, por consiguiente, la presencia de BLEE puede ser enmascarada por la producción de AmpC y como consecuencia un falso negativo.
Aquí el AFB inhibe la AmpC permitiendo determinar la presencia de BLEE por lo que Derbyshire y col. desarrollaron una técnica similar con la finalidad de detectar coexistencia BLEE – AmpC, a través de la utilización de discos de cefepime y cefepime-ácido clavulánico para BLEE, estandarizando el método agregando AFB (20g/L) a los discos de cefotaxime.
PROCEDIMIENTO
- Inocular una placa con agar Mueller-Hinton según el método convencional
- Colocar el disco de CTX+AFB y el de CTX-ácido clavulánico+AFB.
RESULTADO
Un incremento de 3mm o más en el diámetro del halo del disco de CTX+ácido clavulánico+AFB, en comparación con el disco de CTX+AFB, se considera una prueba positiva para BLEE.